潔凈室的送風是通過高效（亞高效）過濾器過濾后進入室內的，可以視為無菌空氣，但這一過程并沒有殺菌作用。只要室內有人員的活動，就會產塵及產菌。人的皮膚由于新陳代謝會不斷脫落皮屑，這可成為微生物生存及繁殖的營養源，在適宜的溫濕度條件下，會使微生物迅速繁殖。潔凈室最有效除菌方法是采用凈化空調系統，但凈化空調系統不能提供潔凈室的起始無菌狀態，用消毒滅菌的方法可彌補這一缺陷。因此，每間潔凈室都應有完善的消毒滅菌制度，將凈化空調技術與消毒滅菌技術有機地結合起來，以保證室內的潔凈無菌環境。
醫院潔凈室的消毒滅菌方法，主要有紫外線照射、臭氧及化學消毒劑消毒滅菌等方法。潔凈室應根據使用特點來確定消毒滅菌方法及周期，有的潔凈室需每日消毒，而有的潔凈室每周消毒一次即可。如手術室的無影燈位于手術臺上方，對手術的影響較大，應每個手術日消毒一次。
一、紫外線滅菌燈照射 屬電磁輻射消毒法，其機理是:紫外線照射后，導致蛋白質（尤其是酶蛋白）上殘基、氫鍵和酶的結構破壞，從而使酶失活，微生物死亡；可使蛋白質變性，影響微生物的生長、代謝；核酸吸收紫外線后改變其生物學活性，導致細菌的死亡；可改變DNA的結構，使細胞無法復制，而使微生物死亡。可見，紫外線屬廣譜殺菌類，能殺死一切微生物。紫外線照射消毒法被廣泛應用于醫院許多需要消毒的場合，如室內空氣、物體表面、水及其他液體等（表面殺菌效果最好）。紫外線殺菌的波長在200～290m，而在250～270nm范圍內的殺菌能力最強。
影響紫外線殺菌的主要因素有:
1、燈管使用的時間:一般使用時間為100h。應定期用儀器測試燈管的輸出強度，新燈管的紫外線照射強度應大于90μW/cm2，當燈管的紫外線照射強度低于70W/cm2時，應予以更換。
2、環境溫度:最適宜的溫度為20℃。
3、環境濕度:一般相對濕度在40％～60，紫外線殺菌效果最好，而相對濕度在60％～70％時，紫外線殺菌效果降低，濕度高于80％的環境對紫外線燈的出力影響最大，甚至對細菌有激活作用。
4、照射距離:照射距離與滅菌效果成反比關系實驗證明，在距燈管中心近距離范圍內，照射強度與距離成反比。
另外，使用紫外線燈管照射時，對需消毒的暴露對象應長時間照射，盡量近距離照射。由于紫外線輻射對人體有傷害，所以只能在無人狀態下使用。同時，紫外線只能對靜止的物體有滅菌作用，對流動的空氣就毫無意義了在組合式空調機組停運時，紫外線照射也可作為機組消毒的一種手段。根據紫外線殺菌的原理制成的專用產品有紫外線空氣消毒器、紫外線表面消毒器和紫外線消毒箱等，以其紫外線強度的強弱及與臭氧的結合滿足不同的消毒要求。
二、臭氧殺菌 臭氧在常溫下是強氧化氣體，也是一種廣譜殺菌劑。可用以殺滅細菌及其芽孢、病毒及真菌，也被廣泛用于潔凈室的殺菌。由于臭氧是極不穩定的氣體，在常溫下會自行分解成為氧氣，故不能儲存。一般都是通過臭氧發生器現場制備，臭氧為強氧化劑，其殺菌能力極強，對人體及室內某些物體也有損害。所以，用高濃度臭氧殺菌，只能在房間無人狀態下進行，殺菌結束30min以后才允許人員進入。
三、化學消毒劑 利用噴霧及熏蒸化學消毒劑的方法殺滅空氣中的微生物也是潔凈室常用的消毒手段。化學消毒劑有甲醛、過氧乙酸、過氧化氫、含氯消毒劑、季銨鹽類等。一般都需關閉門窗1～2h噴霧和熏蒸。還有一些化學消毒劑是可以用來浸泡或擦拭的，如二溴海因、過氧化氫、過氯乙酸等。但無論用什么方法，化學消毒劑對人體及物體都是有不同程度的損害的，在使用時應當經專業人員培訓，操作時應謹慎小心，特別是在配制過程中，應對呼吸系統采取保護措施。需要說明的是每個潔凈室使用的化學消毒劑應當定期更換，防止室內的微生物產生抗藥性。